一、病原特征

1.1草鱼呼肠孤病毒

      草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)隶属水生呼肠孤病毒属，为呼肠孤病毒科（Reoviridae）一新成员，属水生呼肠孤病毒属（Aquareovirus），是该属中致病力最强的毒株之一，是中国大陆分离的第一株鱼类双链RNA病毒。该病毒主要引起中国、朝鲜、越南等亚洲国家淡水养殖主要品种草鱼在鱼种阶段发生出血病，死亡率一般为30%～50%，最高可达60%～80%，还能感染青鱼、麦穗鱼和稀有鮈鲫等。草鱼临床症状表现为体表发黑及不同部位的不同程度出血症状（图1）。该病毒流行广、危害大、死亡率高、发病季节长，严重威胁渔业生产。据不完全统计，每年由于草鱼出血病导致的经济损失至少达10亿元，严重影响了广大草鱼养殖者的积极性和中国淡水养殖业的健康发展。

      根据现有的分离株序列信息，进行核苷酸序列与氨基酸序列比对以及构建系统进化树分析，所有毒株总体上可以分为3大类，即分别把这3类毒株按照基因序列差异分为Ⅰ型(代表株为GCRV-873与GCRV-873-JX09-01)、Ⅱ型(代表株为GCRV-HZ08与GCRV-GD10)和Ⅲ型(GCRV-104与GCRV-HB-1007)。初步的流行病学分析可以得出：目前主要流行的草鱼呼肠孤病毒为Ⅱ型。

1.2 嗜水气单胞菌

      气单胞菌属广泛分布于水和土壤等环境栖息地，是冷血动物和哺乳动物(包括人类)的病原体。气单胞菌可以在大多数食物中被检测出，例如乳制品、蔬菜、肉类和家禽，记录最多的是鱼类和贝类。条件性致病菌嗜水气单胞菌感染宿主范围很广，不仅给水产养殖造成巨大的经济损失，还可以感染人类导致败血症、腹膜炎等，是典型的人-畜-水生动物条件性致病菌。

      嗜水气单胞菌引起的淡水鱼类细菌性败血症，是危害淡水养殖鱼类尤为严重的传染病之一。该病自20世纪80年代末开始流行，其发病急、死亡率高、危害几乎所有的淡水养殖鱼类。嗜水气单胞菌可导致水产动物急性败血症，患病鱼一般呈现肛门红肿、腹部肿大、腹腔积水等症状（图2）。

图1 草鱼出血病临床症状

图2 草鱼气单胞菌败血症临床症状

二、RPA检测方法概述

      重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)简便快捷，是用于鉴定多种病原体的等温扩增方法。RPA引物探针设计要求简单，探针长度46bp～52bp。RPA使用的是带有附属蛋白的重组酶，对操作温度非常宽容，在37 ~ 42℃的温度下反应最理想，然后由聚合酶激发的DNA扩增开始，并在接下来的20～30分钟快速进展指数扩增。反应时间长短取决于起始模板拷贝数和扩增子大小。与传统方法相比，该方法具有反应温度低、反应时间短、不需要昂贵设备等优点，试剂为冻干粉，操作简单，结果可通过侧向流动免疫层析试纸条或实时监测荧光信号进行分析，广泛开发用于疫病病原的现场及实验室检测。

三、 Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒及嗜水气单胞菌RPA检测技术

3.1 Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒RPA检测技术建立

      在基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒特定的保守区域设计多对RPA引物和探针，筛选出最佳组合，其检测灵敏度高、特异性好、检测效果稳定；而且与包括Ⅰ型GCRV和Ⅲ型GCRV 在内的9种鱼类常见病毒和草鱼易感染细菌维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌均无交叉反应，表现出良好的特异性。建立的实时荧光RT-RPA引物、探针及检测试剂盒，对于基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒检测灵敏度为101copy/μl，不需要大型仪器设备，检测时间仅需约30min，大大缩短了检测时间，可用于现场快速检测（图3）。

图3 Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒RPA检测试剂盒

3.2 嗜水气单胞菌RPA检测技术建立

      根据嗜水气单胞菌保守序列设计多对引物和探针并筛选最佳引物探针组合，实验发现最佳引物探针组合在浓度均为10uM时39℃扩增30min为最佳反应条件。检测灵敏度为102copy/uL。特异性检测结果显示，嗜水气单胞菌只在阳性模板有扩增信号，其他常见病原菌无扩增，具有良好的特异性（图5）。重复性实验表明，组内和组间重复变异系数控制在10%。实验结果表明嗜水气单胞菌RPA检测方法的灵敏性和特异性均优于传统PCR方法。

图4 嗜水气单胞菌RPA检测试剂盒